美吉生物

基因表達調控 轉錄組 真核無參轉錄組

真核無參轉錄組 生信分析 技術參數 案例解讀 常見問題 留言咨詢

       無參考基因組的真核生物轉錄組項目使用Illumina測序平臺,獲得測序原始數據后,首先進行質控拼接,并進一步對拼接所得轉錄本進行功能注釋、SNP、SSR標記開發等分析。在此基礎上,也可以進行多個樣本的差異基因表達分析和差異基因功能富集分析等,用于發現功能基因,為下一步研究提供方向。

 

美吉優勢

       ★ 擁有標準化操作實驗室和高通量測序技術平臺,實驗周期短,質量可靠。

       ★ 擁有Illumina HiSeq 2500、HiSeq 4000和MiSeq等多種高通量測序平臺。

       ★ 技術人員經驗豐富,可以根據合作伙伴要求提供實驗方案、解決實驗問題、分析實驗結果。

       ★ 擁有專業的生物信息團隊和大型計算機,可以為合作伙伴提供個性化的生物信息分析服務。


技術路線



組織樣品

       1.動物組織:>2g

       2.植物組織:>4g

       3.細胞培養:>1*107

       4.血液樣品:≥2ml


RNA樣品

       1.請提供濃度≥50ng/,總量≥2μg的RNA(單次建庫用量為1μg),對于總量≥10ng的樣本可以采用微量建庫

       2. OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之間 ,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5, 28S:18S≥1.0,確保RNA無降解

       3.送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封

       4.樣品保存期間切忌反復凍融

       5.送樣時請使用干冰運輸


cDNA樣品

       1. 樣品需求量(單次):建議送樣量≥2μg,對于總量≥500ng的樣本可以采 用風險建庫

       2. 樣品濃度:最低10ng/μL

       3. 樣品純度:OD260/280=1.80-2.00,RIN值≥6.5

       4. 樣品保存期間切忌反復凍融,送樣時請使用干冰運輸

案例一

       對感染過程中樣品進行轉錄組研究是一種了解免疫機制的有效方法。本研究中,作者用草魚呼腸病毒grass carp reovirus (GCRV)對草魚進行感染,對病毒感染前后頭腎及脾臟組織進行轉錄組測序,比較分析獲得了217個顯著的差異表達基因,對免疫相關基因進行表達分析。同時作者還發現了IL-12p40及IL-1R1的可變剪切產生的不同轉錄本在抗病毒免疫中具有不同的功能。

1. 轉錄組表達分析

       將四個文庫(SS1, SR2, KS3,和KR4)與組裝的轉錄組進行mapping。用Trinity軟件進行預測,有54,609個unisequences (53.6%)為蛋白編碼基因。文章進一步對轉錄組reads進行GO分類,注釋到biological process(BP), cellular component(CC)和molecular function(MF)的結果見圖 1。

圖1.C. Idella中GO term的分類和注釋到生物過程、分子功能和細胞組分的分布


2.先天性免疫與獲得性免疫相關基因差異表達分析

       為了研究GCRV感染草魚后草魚的免疫反應,對免疫相關的基因進行表達分析,共篩選出128個與免疫相關的基因。結果表明,先天免疫相關基因在脾臟中平均水平較高,說明脾臟中的免疫反應比腎臟中更強烈。在熱圖中(圖 2-c),KS3 和SS1文庫聚集為一簇,KR4和 SR2文庫聚集為另一簇,說明GCRV感染誘導的這128個基因的表達沒有組織特異性。


圖2. GCRV感染草魚后其免疫相關基因的表達變化


3.草魚的脾臟和腎臟中選擇性剪接事件廣泛存在

       分析表明有11811個unigenes (21.4%)有多個轉錄本,最少2個最多89個,可能發生選擇性剪接。轉錄本發生差異表達的基因稱為DETs。草魚中有2782個DETs,占到unigene的5%。這些DETs參與免疫、核酸結合、化學修飾、pre-mRNA剪接以及其他生物學過程(圖3)。


圖3. a:含多個轉錄本的unigenes所占的比例;

b: GCRV感染各個樣品后表達變化轉錄本的維恩圖。


參考文獻

Wan Q, and Su J. Transcriptome analysis provides insights into the regulatory function of alternative splicing in antiviral immunity in grass carp (Ctenopharyngodon idella). Sci. Rep. 5, 12946; doi: 10.1038/srep12946 (2015).


案例二

       歐洲紅蜘蛛是農場中最主要的害蟲之一,殺螨劑-螺螨酯能夠有效將其殺死。現階段該物種已經對殺蟲劑產生耐藥性,但其耐藥機制尚不明確。本文通過鏈特異性(無參)轉錄組測序方法,獲得了螺螨酯敏感和抗性蜘蛛轉錄組的全面信息。將樣品中解毒酶家族、殺螨劑作用靶點以及植物螨和殺蟲劑抗性水平轉移基因等進行注釋(圖1)。此外,利用差異基因分析,揭示了螺螨酯敏感和抗性蜘蛛中抗性基因的表達差異。該結果為進一步研究歐洲紅蜘蛛對螺螨酯類殺蟲劑的耐藥機制提供了突破點(圖2)。


圖1 歐洲紅蜘蛛轉錄GO功能分類注釋


圖2 殺螨劑抗性和敏感的歐洲紅蜘蛛基因表達差異分析


參考文獻

Sabina B, Wannes D, Robert G,et al. Transcriptome profiling of a spirodiclofen susceptible and resistant strain of the European red mitePanonychus ulmi using strand-specific RNA-seq [J].BMC Genomics, 2015, 16: 974.

(1)如何確定研究物種有無參考基因組?

       根據所研究物種的拉丁文名,可在Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html) 、JGI(http://genome.jgi-psf.org/ )及NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有該物種的基因組信息, 也可在其他專門介紹某種物種的網站尋找參考基因組。


 (2)是否一定要求設置生物學重復,以及重復次數?

       目前沒有生物學重復的實驗發文章比較困難,尤其是IF≥5的雜志。文章投出之后,容易遭編輯質疑。如果確實受限于研究經費,無法設置生物學重復。那就要結合強有力的實驗數據做支撐,比如定量實驗、 FISH熒光原位雜交或Northern blot等,用實驗數據說服編輯。重復設置原則上越多越好,但考慮到現實條件,重復設置≥3。一般不建議設置兩個重復,因為如果兩者結果不一致,我們無法確定以哪個數據為參考。 


(3)多個樣品的轉錄組,如何確定是將所有樣品一起拼接還是每個樣品分開拼接?

       樣品分開拼接的情況,一般適用于不同的物種,同一屬不同的種或者同一物種不同的品系。通過分析同源基因受選擇壓力情況從而鑒定親緣關系。

       同一物種不同個體的混樣,或者同一個體不同組織部位,發育階段樣品建議一起拼接能夠得到該物種更全的轉錄組數據。


 (4)真核生物以轉錄組de novo結果作為reference進行表達譜測序是否可行?

       可以的,但是因為轉錄組具有時空和組織特異性,需要保證表達譜測序樣本要包含在轉錄組測序中,否則此reference沒有意義。

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