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基因表達調控 轉錄組 互作轉錄組

互作轉錄組 生信分析 技術參數 案例解讀 常見問題 留言咨詢

       物種間存在廣泛的相互作用,包括寄生、共生、競爭等,而普通的轉錄組只能研究單一物種的信息,不僅浪費一部分數據,而且在分離中也會對樣本本身造成一定的影響。而互作轉錄組,無需分離兩物種,避免分離造成的干擾,只構建一個轉錄組文庫便可得到兩物種的信息。同時,還可以通過互作模型圖獲得物種間基因的調控關系,得到兩物種間的相互作用機制。

 

美吉優勢

       1. 獨具特色的取樣建庫流程,有效提高侵染物種的數據量;

       2. 新增研發分析內容,更好揭示物種間相互作用關系 ; 

       3. 經驗豐富的技術和生信分析團隊,并有強大的計算機平臺作支撐; 

       4. 從實驗方案設計到后期數據挖掘,全面助力您的科學研究。 

應用范圍

      1. 植物病害與抗病感病機理

      2. 生理適應與分子響應

      3. 病原菌入侵與宿主免疫

      4. 物種間共生機理

      5. 物種共進化

組織樣品 

        1. 動物組織:>2g 

        2. 植物組織:>4g 

        3. 細胞培養:>1*107

        4. 血液樣品:≥2ml 

        5. 菌體沉淀:2-4ml (密度約1*107個/ml,對數期或穩定初期) 

RNA樣品 

        1. 真核樣本請提供濃度≥50ng/μL,總量≥2μg的RNA(單次建庫用量為1μg),原核樣本請提供濃度≥100ng/μL,總量≥4μg的RNA(單次建庫用量為2μg),對于總量不足常規建庫但多于10ng的樣本可以采用微量建庫; 

        2. OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之間,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,28S:18S≥1.0,確保RNA無降解; 

        3. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封; 

        4. 樣品保存期間切忌反復凍融; 

        5. 送樣時請使用干冰運輸; 

測序量

        1. 真核對照樣本參照真核轉錄組測序量,為6G clean data

        2. 原核對照樣本參照原核轉錄組測序量,為2G clean data

        3. 真核-真核、真核-原核互作樣本轉錄組測序量,為10G clean data(具體可視情況而定)。

建庫方式

        1. 真核-真核互作轉錄組測序一般采用ployA富集方式得到mRNA

        2. 真核-原核互作轉錄組測序一般采用去除核糖體RNA方式得到mRNA

案例1 沙門氏菌感染人細胞系

美國、奧地利和德國學者利用dual RNA-seq技術,以沙門氏菌和人細胞系為互作模型,研究了細菌sRNA與宿主基因的作用機制。沙門氏菌感染宿主細胞0h4h24h后,對宿主細胞和沙門氏菌基因進行分析。研究發現,沙門氏菌sRNA中的PinT上調最為明顯,同時PinTPhoP調控;此外,PinT可以調控自身毒力相關基因SPI-1下調、存活相關基因SPI-2上調,而SPI-2可以調控宿主JAK–STAT信號通路上調。

 

圖 沙門氏菌侵染宿主后兩者相互作用模式

案例2 灰葡萄孢菌染萵苣

       B. Cinerea侵染L. Sativa 12h24h48h后,進行轉錄組測序。測序數據與參考基因組mappingmappingL. Sativa參考基因組的比率為77%左右,而mappingB. Cinerea參考基因組的比例隨著侵染時間延長而升高,其中在侵染后48h5.5%。侵染的三個時期中,病原菌與宿主中共檢測到11394598個差異變化基因,占總注釋到基因的44%。通過GO富集發現,宿主中上調的基因大都與植物防御病原菌相關。

                                    不同侵染時期基因表達水平heatmap                           侵染48h后代謝通路變化


參考文獻

1. Westermann A J, F?rstner K U, Amman F, et al. Dual RNA-seq unveils noncoding RNA functions in host–pathogen interactions[J]. Nature, 2016, 529(7587).

2. De C K, Mathys J, Vos C, et al. RNAseq-based transcriptome analysis of Lactuca sativa infected by the fungal necrotroph Botrytis cinerea[J]. Plant Cell & Environment, 2013, 36(11):1992–2007.

1. 互作轉錄組相對普通轉錄組有何優勢?

       互作轉錄組是針對兩種或兩種以上具有相互作用的物種,一般互作方式包括共生、寄生、競爭以及捕食等。普通轉錄組需要對兩種物種分離,但是會浪費部分信息并會帶來其他的影響,而互作轉錄組可同時研究兩種或更多的物種,無需分離,排除分離帶來的影響;成本更低,只構建一個轉錄組文庫,便可同時分析兩個物種,最終得到兩個物種基因間的調控關系。

2. 兩個互作物種必須都有參考基因組嗎?

       理論上,最好是兩個物種都有參考基因組,得到的結果更準確。但是也有文獻報道,互作樣本中只有一個物種有參考基因組,其分析流程是先將測序數據與有參考基因組物種進行mapping,將mapping數據剔除后的轉錄組數據,可以選擇與近緣物種mappingdenovo拼接的方式得到另一物種的信息,進一步進行分析。但是對于互作樣品中的原核部分必須有參考基因組,如果沒有參考基因組,可以通過細菌掃描圖實現。

3. 互作物種中,侵染的物種可能數據量會很少,如何獲得侵染物種比例或提高侵染物種比例?

        一般情況下,宿主細胞被侵染的占比會很少,但是一個細胞中可能會被多個細菌侵染。以細菌為例,文獻報道平均為1個細胞中感染1-20個左右的細菌不等,也視情況而定。如何在測序前獲得侵入宿主細胞的比例,宿主與感染菌的RNA占比,可以通過前期的qRT-PCR實驗檢測保守基因或者顯微鏡觀察等其他試驗獲得;而對于提高病原菌比例,可以在取樣時盡量選擇病斑位置或通過延長侵染時間以提高病原菌比例,另外也可以通過熒光標記等方式分離已入侵的細胞從而提高侵染物種比例。

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