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基因表達調控 非編碼RNA circRNA測序

circRNA測序 生信分析 技術參數 案例解讀 常見問題 留言咨詢

? ? ? ?circRNA是一大類非線性RNA,作為調控因子發揮著巨大作用。circRNA具有大量存在,進化保守,在細胞質中相對穩定的特點。這使得circRNA具有許多的功能,例如作為miRNA的海綿,綁定RNA形成RNA-蛋白復合物,調控基因的轉錄。circRNA測序能夠在整體水平上解釋樣品中circRNA的分類信息、表達量信息等,通過分析其與miRNA的互作關系探討ceRNA調控機制。

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適用范圍

? ? ? ?1)作為ceRNA調控網絡機制研究中的重要成員

? ? ? ?2)從全血中檢測circRNA來研究circRNA是否可以作為未來疾病診斷的biomarker

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技術優勢

? ? ? ? 采用核糖體去除、鏈特異性文庫構建、以及RNase R消化方案,既能獲取完整的環狀RNA和線性RNA序列,也可以僅保留環狀RNA序列。
? ? ? ? 能夠分析ceRNA調控機制。

組織樣品

? ? ? ?1.動物組織:>2g;

? ? ? ?2.植物組織:>4g;

? ? ? ?3.細胞培養:>1*107個;

? ? ? ?4.血液樣品:≥2ml。


?RNA樣品

? ? ? ?1.請提供濃度≥ 200ng/μL,總量≥10μg的RNA;

? ? ? ?2 .OD260/280介于1.8~2.2之間,OD260/230≥2.0,RIN≥6.5,28S:18S≥1.0,確保RNA無降解;


cDNA樣品

? ? ? ?1.樣品需求量(單次): 建議送樣量≥2μg,對于總量≥500ng的樣本可以采用風險建庫

? ? ? ?2.樣品濃度: 最低10ng/μL

? ? ? ?3.樣品純度:OD260/280=1.80-2.00,RIN≥6.5


建庫測序

? ? ? ?建庫:去除rRNA鏈特異性建庫,或者去除rRNA線性消化鏈特異性建庫

? ? ? ?測序策略:Illumina PE測序(150×2)

? ? ? ?測序數據量:去除rRNA鏈特異性建庫≥12G,線性消化建庫6-8G

案例一

? ? ? ?本研究利用RNA-seq技術對豬胚胎6個不同發育階段(E23、E42、E60、E80、E100和E115)的腦皮層進行了circRNA研究。通過對測序數據進行分析,共鑒定了9377個候選circRNA,其中表達量高于0.05 RPM(back-spliced reads per million raw reads)的有4634個,且circRNAs的數量隨著發育的進行而增加,到E60期達到頂峰,隨后出現銳減現象,這說明circRNAs在腦皮層發育的前期發揮重要作用。circRNA在不同發育階段(E60和E115)不同腦組織(基底核、腦干、小腦和海馬區)的表達也具有時空性,即在不同組織以及組織的不同發育階段都不同,另外,在E60發育階段表達的circRNAs的host gene主要與軸突導向、Wnt信號和TGF-β信號通路有關。


圖1 CircRNA在不同腦組織(基底核、腦干、小腦和海馬區)中的時空表達情況.

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A.表達的circRNAs在不同腦組織中的數量分布

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? B. circRNAs在E60和E115時期的表達模式聚類圖

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C. CiRS-7(已知circRNA)在E60和E115時期不同組織中的表達


案例二?

? ? ? ?本研究利用RNA-seq技術,采用去除rRNA的方式建庫分析來自6個正常組織(腦、結腸、心臟、肝、肺、胃)和7個癌癥組織(膀胱尿路上皮癌、乳癌、結直腸癌、肝癌、胃癌、腎透明細胞癌、前列腺癌)的circRNA。研究發現了67,358個潛在的circRNA,其中27,296含有至少兩個unique back-spliced reads。許多circRNA在正常組織與癌癥組織中具有表達差異(圖1),同時發現了一個豐富的環狀RNA?circHIPK3,來自?HIPK3?基因Exon2。沉默circHIPK3以后,發現人類細胞的生長受到顯著的抑制。通過熒光素酶篩選實驗發現,circHIPK3具有18個miRNA bind sites(圖2)。circHIPK3能夠直接結合?miR-124,抑制?miR-124的活性。


圖1 circRNA的表達統計及其在正常組織與癌癥組織中的表達豐度


圖2 針對circHIPK3的熒光素酶篩選實驗

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參考文獻

[1]Morten T. Ven?, Thomas B. Hansen, Susanne T. Ven?,et al. Spatio-temporal regulation of circular RNA expression during porcine embryonic brain development[J].Genome Biology, 2015, 16(1):1-17.

[2]Zheng?Qiupeng, Bao?Chunyang, Guo?Weijie,et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J].Nature Communications, 2016, 7.

去除rRNA鏈特異性建庫,與去除rRNA線性消化鏈特異性建庫的優缺點???

(1)去除核糖體,構建去rRNA文庫,在此基礎上使用生物信息學方法預測circRNA

? ? ? ?優點:不需要使用RNase R減少部分實驗消耗,可以同時研究mRNA, lncRNA, circRNA。

? ? ? ?缺點:只能研究部分高表達的circRNA,無法大規模檢測,需要較高的測序數據量準確度差。

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(2)去除核糖體,使用RNase R去除線性RNA

? ? ? ?優點:circRNA檢出量高, 是第一種方案的20倍circRNA鑒定準確度高。

? ? ? ?缺點:由于消除了線性RNA,mRNA,lncRNA與circRNA表達水平將會失真。

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