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蛋白質組學和代謝組學 定量蛋白質組學 SILAC

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??????? SILACstable-isotope labelling by amino acids in cell culture)技術,指利用含輕、中或重型同位素標記的必需氨基酸(主要是Lys和Arg)培養基培養多組細胞,標記細胞內新合成的蛋白質,一般培養5-6代,細胞中的蛋白質將都被同位素標記。比如A組和B組,A組是在包含正常氨基酸(light)的培養基中;B組的培養基則含有“重型(heavy)”的氨基酸,即穩定同位素標記的氨基酸。細胞5-6代后,穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到蛋白中,取代了原有的氨基酸,這樣,兩個蛋白之間就存在分子量的改變,而其它化學性質無異。然后將兩組細胞混合,提取出蛋白質,質譜進行測定。通過比較質譜圖中肽段信號峰的峰面積大小進行相對定量研究。該技術適用于細胞和動物的體內標記,具有系統誤差小,定量準確,并且可以進一步尋找具有時效性變化的差異蛋白,更精準地研究刺激的作用機理等技術特點。

細胞實驗流程


動物實驗流程




技術平臺

Triple TOF 5600, Q-Exactive, Orbitrap Fusion? Tribrid?

技術優勢

?????? 高通量:可同時鑒定并定量數百至數千種蛋白質;

??? 定量精確:降低由于樣品制備不同而造成的實驗差異;

? 線性定量范圍廣;???

? 靈敏度更高:蛋白質需要量明顯減少;

? 重要的的體內標記技術,更接近樣品真實狀態,適用于培養細胞或者小鼠蛋白質表達動態變化研究。

應用領域

機理和調控機制研究?

動態過程中機制研究

疾病標志物的篩選??

用藥及預后標志物篩選




生信分析


?送樣要求

樣品類型

樣品要求(/組樣品)

備注

蛋白質溶液

蛋白質總量≥300μg

重復實驗則量翻倍,建議準備兩份樣品備用。

組織樣品

樣品總量≥0.1g

按照蛋白質組織提取效率(蛋白:組=7%

細胞樣品

細胞數量≥107

胰酶消化,按細胞凍存標準離心收集細胞即可。

體液樣品

清≥200μL,腦脊液≥200μL,尿液≥1mL ,淚液≥1mL.

?


案例:細胞信號通路中T細胞精氨酸甲基化的變化差異

? ? ? ? ? 本文研究精氨酸甲基化在免疫調節中的作用,通過異甲硫氨酸甲酯的SILAC培養基培養人T細胞進行實驗,共鑒定到了1257個看家蛋白質的2502個精氨酸甲基化位點,發現精氨酸甲基化轉移酶在T細胞活化和分化過程中起到了關鍵作用




參考文獻:

? ? ? ?Geoghegan, V., et al. (2015) Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature communications 6, 6758.




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